照明光源角度不同对显微拍摄成像的影响

光线照射到物体时，一部分光被物体表面反射（包括镜面反射和漫反射），另一部分光则穿越物体，被物体吸收或穿过物体透射出去^[1]。摄影时，只有进入相机镜头的光才能成像，照明光源与相机之间的角度不同，进入相机的反射光和透射光的配比与强度会发生改变，因此成像效果不同^[2]。当光源与相机同侧，光源范围在相机透镜视野的两倍以内，即光源在“W”区（明场）之内，光柱垂直（或较小的倾斜角度，由于物镜与被摄体的距离非常接近，故该倾角很小）照射到样品的表面，光线经被摄物镜面反射（发射光线都朝同一方向）进入相机镜头（图1），成像背景明亮，称为明场成像；当光源在“W”区之外（称为暗场），光柱以较大倾角倾斜照射到样品的表面，镜面反射光线被反射离开，漫射光（反射光线朝向各个方向）被反射进入照相机（图1），成像背景灰暗，称为暗场成像^[3]。当光源和相机在被摄物的两侧，光柱穿过被摄物（必须是透明的）后的透射光进入相机镜头（图1），背景明亮，形成强对比度成像，亦为明场成像，成像主要为被摄物的内部结构。由于普通光学显微镜的放大倍率是体视显微镜的5-10倍，且分辨率高^[4]，因此，本文通过增设普通光学显微镜的照明光源，以薜荔榕小蜂（Wiebesia pumilae）幼虫和榕小蜂Sycophila sp.(♀)成虫（小于5mm的微小样品）为例，探究照明光源角度不同对显微拍摄成像的影响。

图1 明场成像与暗场成像示意图

1  光源设置 

分别设置了三种光源：①上光源，自制小型冷光源阴极环形灯，通过旋钮套扣在物镜上^[5]，使光线从上方接近垂直照射被摄样品；②侧光源，利用台式ULP-301-SL可移动LED冷光源，从显微镜载物台的两侧(与物镜间的夹角为80°)照射拍摄对象；③下光源，为显微镜配套的光源。利用Olympus BX51显微镜进行分层拍摄，通过景深扩展软件（Image-Pro Plus）进行图像合成。

2  成像效果对比

薜荔榕小蜂幼虫为光面、透明的样品，利用上/侧光源拍摄光面样品均易产生镜面反射，即成像时，在样品表面产生块状或环状，称之为“高光”的特亮区域（图2-A），即看不到该区结构，成像为白色，但高光区又是被摄体立体感成像不可或缺的要素。利用上光源拍摄小蜂幼虫，由于物体表面的镜面反射，大量反射光进入镜头，故表面结构成像细腻丰富，形变小，成像立体感强（图2-A）；利用侧光源拍摄时，光线倾斜照射虫体，大量镜面反射光逸出镜头，进入镜头的多为漫反射光，因此成像照度（受照面明亮程度）均匀，但样品表面细节特征成像模糊，立体感较弱。由于一部分光线透过虫体，被吸收或形成透射光进入镜头，因此幼虫内部中肠的结构和位置较为清晰（图2-B）。

图2  不同样品在不同角度光源照明下的成像效果

A-C：薜荔榕小蜂幼虫；D-E：Sycophila sp.(♀)成虫。A、D：上光源照明；B、E：侧光源照明；C：下光源照明，图中体壁（in：integument）成像主要为白色，口器（m：mouthpart）成像为黑色，中肠（mi：midgut）成像为黄色。

下光源只能拍摄透明的样品，光线经样品透射后进入镜头，成像平面化，无立体感，背景明亮，光比（不同区域间的明暗差异）大。成像色彩取决于样品对光的吸收和透射：未吸收光的部位（即光全部透过），例如体壁，成像为高光区（白色）；不透光的部位，例如幼虫骨质的口器，成像为暗区（黑色）。幼虫中肠将黄色以外的色光吸收，仅黄色光透过，故在成像中呈现黄色（图2-C）。

榕小蜂成虫Sycophila sp.(♀)为不透明样品，但由于头（眼）、胸、腹和翅各部分的表面结构不同，成像效果也各不相同。例如：

（1）上光源照明在半球形复眼（糙面）上形成柔和的顶面环形明区，在视觉上复眼显得较为扁平（图2-D）；在侧光源照明下，复眼的两侧面形成明区，暗区与明区的光比大且逐渐过渡，层次丰富，故此时复眼成像在视觉上较为立体（图2-E）；在拍摄表面粗糙、质地透明的样品（例如茎叶徒手切片）时，成像效果与此相同。

（2）若糙面起伏较大形成凹凸不平状，如小蜂胸部在上光源照明下的成像明亮、均匀、柔和，明区和暗区间的光比小，昆虫体表的细节特征全面，但立体感差（图2-D）；侧光源照明下的小蜂胸部成像光比大，通常是最亮的区域曝光过度形成白色高光斑，而最暗的区域因曝光不足难以成像，因此，虽立体感强，但曝光度难以调节。如侧光源照明中位于暗区的触角，毛形触角感觉器成像缺乏细节特征，甚至连分节都十分模糊（图2-E）。

（3）小蜂的腹部光滑，上光源和侧光源照明都会产生高光斑，但上光源形成的高光斑面积通常较大，上光源照射小蜂腹部形成的环形高光斑，易造成腹部凹陷的错觉（图2-D）。

（4）小蜂的膜翅，平面、透明具光泽，附着在虫体上的翅，因悬空并与照明光线成一定角度，翅的反射光和透射光均可进入镜头，不同光线之间的干扰，使光泽难以成像。若将单独拍摄翅，在上光源照明下，由于进入镜头的反射光多，翅的彩色光泽展示得充分（图2-D，尤其在黑色背景下，去除了透射光的干扰，色彩更为艳丽），侧光源照明则显得暗淡无光泽（图2-E）。

表1  光源、样品、成像效果之间的相关性

综上所述，成像效果不仅与照明光源的角度有关，也与被摄样品的表面结构（光面/糙面/凹凸面）、立体结构（平面/立体），以及质地（透明度）有关，光源、样品、成像效果之间的相关性见表1，我们必须根据不同的拍摄目的和要求，选择合适的照明光源。

作者：福建师范大学生命科学学院     赵萌 陈小贞 吴文珊

主要参考文献

[1] 岳春敏, 韩福利, 李志宏, 等. 基于面反射偏振解析的物体表面形状测定[J].长春理工大学学报(自然科学版), 2007, 30(4) : 27 - 30. 

[2] 弓  宇, 郭英玲, 张  枫, 等. 基于反射光和透射光成像的图像识别方法比较[J].机电产品开发与创新, 2013, 26(3) : 7 - 8.

[3] LIU Z, TIAN L, LIU S, et al. Real-time brightfield, darkfield, and phase contrast imaging in a light-emitting diode array microscope[J]. Journal of Biomedical Optics, 2014, 19(10) : 106002.

[4] 张  斌. 1×～6.3×连续变倍体视显微镜物镜的光学设计[J].光学仪器, 2002, 24(6) : 25 - 29.

[5] 蔡美满，吴文珊，张彦杰. 利用普通光学显微镜拍摄小型昆虫[J].生物学教学, 2012, 37(3) : 36 - 36.