我院欧阳松应教授课题组研究成果在《Nature》子刊上发表
近日,我院欧阳松应教授课题组在CRISPR-Cas系统结构与功能方面取得最新进展,研究成果以题为“Two HEPN domains dictate CRISPR RNA maturation and target cleavage in Cas13d”发表在《Nature》子刊《Nature Communications》((2019) 10:2544, https://doi.org/10.1038/s41467-019-10507-3)(影响因子:12.353)。我院为第一完成单位,欧阳松应教授为独立通讯作者。这是该课题组在《Cell Research》(2018,影响因子:15.353)期刊上发表该领域研究成果之后的又一力作[2]。该研究解析了瘤胃球菌unculturedRuminococcus sp.Cas13d(简称UrCas13d)蛋白与CRISPR RNA(简称crRNA)二元复合物高分辨率晶体结构,揭示了UrCas13d加工precursor crRNA(简称pre-crRNA)的酶活性关键位点,UrCas13d对crRNA repeatregion的核酸序列与结构的特异性识别,两个水合镁离子对于稳定crRNA repeat region的构象发挥着重要作用,鉴定了crRNA spacerregion和靶RNA之间的错配耐受性等尚未研究清楚的科学问题。本研究成果为进一步改造Cas13d作为核酸编辑及检测工具,并发挥其在解决人类疾病与健康等问题上的应用潜力,提供了扎实的结构基础和理论依据。
CRISPR-Cas系统是原核生物中存在一种规律成簇的间隔短回文重复DNA序列。CRISPR-Cas系统表达的非编码RNA(CRISPR RNA,crRNA)及其相关蛋白(CRISPR associated protein, Cas)组成的复合物使得原核生物能够识别并且抵御外源核酸物质的入侵。CRISPR-Cas系统主要分为两类,它们各自又由多个类型及亚型组成。第二大类CRISPR-Cas系统中的II型CRISPR-Cas9系统和V型CRISPR-Cas12a(Cpf1)系统,已经广泛并高效地应用于多种生物的基因组编辑。Cas9可以纠正个体细胞内的基因缺陷,已经从实验室研究阶段进入到临床研究阶段,具有治愈或预防多种人类疾病的潜力;然而,Cas9系统和Cas12a系统主要负责编辑DNA。针对RNA的编辑工具可以在RNA水平调节基因的功能,而不会对基因本身造成永久性改变。
图1. UrCas13d-crRNA二元复合物的结构示意图
(a)UrCas13d各结构域分布;(b)crRNA二级结构的示意图;(c)二元复合物的三维结构示意图;(d)二元复合物各结构域的表面示意图;(e)crRNA重复区域中五水合镁离子及其周围核苷酸的电子密度图;(f)五水合镁离子与其周围核苷酸、氨基酸残基之间相互作用的细节信息;(g)UrCas13d及其突变体对靶RNA切割的尿素变性凝胶电泳检测结果;(h)四水合镁离子及其周围氨基酸残基的电子密度图;(i)四水合镁离子与其周围氨基酸残基、核苷酸之间相互作用的细节信息;(j)二价金属离子或EDTA存在情况下,UrCas13d加工pre-crRNA的尿素变性凝胶电泳检测结果;(k)二价金属离子或EDTA存在情况下,UrCas13d对靶RNA切割的尿素变性凝胶电泳检测结果。
2018年4月,美国Salk研究所Patrick Hsu课题组和Arbor生物技术公司分别报道了一种新型Cas效应蛋白,属于第二大类VI型RNA依赖的核糖核酸酶(RNase),并命名为Cas13d,该蛋白可做为一种强大RNA编辑工具用于纠正痴呆症患者细胞中引起疾病的蛋白质失衡[3, 4]。与VI型其他成员类似,Cas13d具有两个HEPN(higher eukaryotes and prokaryotes nucleotide-binding)结构域,自身可以加工pre-crRNA成为成熟的crRNA,结合靶RNA激活其RNase活性。虽然,Cas13d在功能上与其家族成员Cas13a-c具有一定的相似性,但是Cas13d具备一些独特之处。首先,Cas13d的蛋白序列平均长度为930个氨基酸残基,在同类蛋白中明显偏小(比其家族成员Cas13a-c小20%,比Cas9小33%),使它更容易包装到容量有限的应用载体中(比如adeno-associated virus, AAV);其次,除了两个HEPN结构域之外,Cas13d与其他Cas13家族成员之间没有明显的序列相似性;另外,在切割靶RNA时,Cas13d的靶RNA序列两端都无须PFS(protospacer flanking sequence);此外,含有WYL结构域的辅助蛋白可以增强Cas13d的底物酶切活性。因此,Cas13d更有潜力作为一种可操控的RNA结合模块,有效靶向细胞内的RNA转录物,为转录组工程和疾病治疗提供了一个通用平台。2018年9月,美国Salk研究所Patrick Hsu课题组和Dmitry Lyumkis课题组合作,利用低温电镜技术率先报道了惰性真杆菌Eubacteriumsiraeum Cas13d(EsCas13d)不同功能状态下的复合物冷冻电镜结构[5]。
图2. crRNArepeatregion结构与序列的特异性识别
(a)crRNArepeatregion结合在UrCas13d的NTD,HEPN-1和HEPN-2结构域形成的孔道中,其核苷酸U(-24)-A(-13)暴露在蛋白表面外;(b)UrCas13加工pre-crRNA或其△-stem突变体(pre-crRNA缺失了核苷酸U(-24)-A(-21)/U(-16)-A(-13))的尿素变性凝胶电泳检测结果;(c)UrCas13d与crRNA或其△-stem突变体(crRNA缺失了核苷酸U(-24)-A(-21)/U(-16)-A(-13))形成的复合物切割靶RNA的尿素变性凝胶电泳检测结果;(d)UrCas13d加工pre-crRNA或其突变体的尿素变性凝胶电泳检测结果;(e)UrCas13d与crRNA或其突变体形成的复合物切割靶RNA的尿素变性凝胶电泳检测结果。
本研究中,欧阳松应教授课题组解析了UrCas13d蛋白和crRNA二元复合物1.86Å高分辨率的晶体结构,并开展了相应的功能实验[1]。发现在UrCas13d-crRNA二元复合物中,成熟的crRNA结合在UrCas13d的紧凑双叶型结构所形成的通道内,两个水合镁离子对于稳定crRNArepeat region的构象发挥着重要作用;其中一个五水合镁离子通过多个氢键稳定crRNA repeatregion的构象,将与该水合镁离子直接相互作用的氨基酸残基突变,发现靶RNA切割活性显著降低。进一步的实验表明,二价金属离子对于pre-crRNA加工不是必需的,但对于Cas13d的靶RNA切割是至关重要的;与Cas13家族其他成员的研究结果相比所不同的是,UrCas13d蛋白加工pre-crRNA的酶活性中心位于HEPN-2结构域上,其氨基酸残基R802和K905对于pre-crRNA切割是极其重要的;crRNA repeatregion的核苷酸U(-8)-C(-1)的序列和结构被UrCas13d特异性识别,该区域的核酸序列和三维结构对于靶RNA的切割是必需的;在二元复合物中,crRNArepeat region的核苷酸U(-24)-A(-13)暴露于环境溶剂中,删除该区域内四个Watson-Crick碱基对(base pair)既不改变UrCas13d的pre-crRNA加工能力也不改变其靶RNA切割能力;针对UrCas13d两个HEPN结构域上靶RNA切割关键位点R288A或H828A,突变体蛋白足以破坏蛋白对靶RNA切割活性。此外,通过crRNA spacerregion和靶RNA之间的错配耐受性实验,研究发现spacerregion的两个子区域(an internal and a 3¢-end region)与靶RNA之间的正确碱基配对对于靶RNA切割是必需的。
图3. UrCas13d参与pre-crRNA加工及靶RNA切割的酶活性位点
(a)参与pre-crRNA加工的UrCas13d酶活性位点示意图;(b)野生型UrCas13d及可能参与pre-crRNA加工的UrCas13d突变体加工pre-crRNA的尿素变性凝胶电泳检测结果;(c)切割靶RNA的UrCas13d酶活性位点示意图;(d)crRNA与靶RNA之间错配耐受性的示意图;(e)crRNA与靶RNA错配耐受性的尿素变性凝胶电泳检测结果。
我院副研究员张博博士和研究生叶阳苗为本文的共同第一作者,该研究得到国家自然科学基金和福建师范大学的经费资助,上海同步辐射光源(SSRF)BL-17U1对该研究提供了重要的技术支持。
原文链接:https://www.nature.com/articles/s41467-019-10507-3
[1].Zhang, B. et al. Two HEPN domains dictate CRISPR RNA maturation and target cleavage in Cas13d. Nature Communications.10:2544(2019). DOI:10.1038/s41467-019-10507-3.
[2].Zhang, B. et al. Structural insights into Cas13b-guided CRISPR RNA maturation and recognition. Cell Res28, 1198–1201 (2018).
[3].Konermann, S. et al. Transcriptome Engineering with RNA-Targeting Type VI-D CRISPR Effectors. Cell173, 665-676 e14 (2018).
[4].Yan, W.X. et al. Cas13d Is a Compact RNA-Targeting Type VI CRISPR Effector Positively Modulated by a WYL-Domain-Containing Accessory Protein. Mol Cell70, 327-339 e5 (2018).
[5].Zhang, C. et al. Structural Basis for the RNA-Guided Ribonuclease Activity of CRISPR-Cas13d. Cell175, 212-223 e17 (2018).